我院生殖健康研究所基因编辑应用技术研究组与上海交通大学医学院附属第九人民医院/上海精准医学研究院乔云波、魏皎团队联合国际和平妇幼保健院、复旦大学、山东大学齐鲁医院等单位，在国际知名期刊《Nature Communications》（中科院1区，IF=18.1）在线发表题为Guide RNA reprogramming facilitates minimized tracrRNA-dependent off-target and versatile CRISPR/Cas9 engineering的研究论文。我院于文霞助理研究员为共同第一作者。

该研究首次揭示了CRISPR/Cas9系统中一种此前未被认识的脱靶机制——tracrRNA-dependent off-target（TDO），并基于向导RNA（gRNA）重编程策略，建立了兼具高安全性和多功能性的segRNA技术平台，为CRISPR基因编辑技术的安全应用和功能拓展提供了新的理论基础和技术方案。

CRISPR/Cas9基因编辑技术因其高效、精准等优势，已成为生命科学和精准医学研究的重要工具。然而，脱靶效应始终是制约其临床转化的重要因素。目前，大多数研究主要关注sgRNA与基因组DNA之间的序列错配，而对于gRNA本身结构可能引发的新型脱靶机制认识仍十分有限。

针对这一问题，研究团队回归天然Ⅱ型CRISPR系统的结构特征，系统研究了crRNA与tracrRNA之间的相互作用规律。研究发现，在哺乳动物细胞内，传统sgRNA中的crRNA双链具有可拆分、可重编程的重要特性。细胞内大量内源RNA能够与外源tracrRNA重新配对，形成新的功能性guide RNA复合物，从而介导Cas9产生低频但广泛存在的DNA编辑事件。研究团队将这一此前未知的脱靶模式命名为tracrRNA-dependent off-target（TDO）。

进一步的生物信息学分析显示，人类转录组中存在大量潜在的TDO相关位点，这意味着传统脱靶评估体系可能低估了CRISPR系统的真实风险。研究结果为解释部分传统DNA错配模型无法解释的异常编辑现象提供了新的理论依据。

针对这一新发现，研究团队构建了近6000种gRNA骨架变体组成的大规模文库，并结合机器学习模型，系统解析了crRNA-tracrRNA配对结构对编辑活性的影响规律，建立了gRNA结构优化设计原则。基于该策略，团队成功设计出兼具高编辑效率和低TDO风险的新型gRNA骨架，实现了在保持编辑活性的同时显著降低脱靶风险。

在机制研究基础上，团队进一步充分挖掘gRNA重编程策略的应用潜力，成功开发出多项CRISPR新工具平台。研究人员构建了基于CRISPRa的活细胞RNA检测系统，实现了内源编码RNA及长链非编码RNA的实时检测；针对PAM-free SpRY-Cas9存在的自编辑问题，通过优化gRNA结构显著降低了系统自编辑风险；同时，利用天然分体RNA结构特点，建立了高效多基因同步编辑平台，实现了多个基因的稳定、高效联合编辑，并成功应用于小鼠胚胎干细胞增强子功能解析及多基因功能研究，展示出良好的应用前景。

综上，传统通过优化Cas9蛋白或DNA靶序列降低脱靶的研究思路，从gRNA结构本身出发，首次揭示了CRISPR/Cas9系统新的脱靶来源，并建立了机制解析、机器学习优化、安全设计和功能拓展于一体的技术体系。新开发的segRNA平台不仅有效提升了CRISPR系统的安全性，同时兼具RNA检测、多重编辑及功能基因组研究等多种应用能力，为下一代CRISPR工具开发及基因治疗临床应用提供了新的研究方向。

未来，该成果有望进一步推动CRISPR基因编辑技术在精准医学、疾病治疗、功能基因组学及合成生物学等领域的广泛应用，为高安全性基因编辑技术的发展提供重要支撑。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-74520-z

供稿：院生育所基因编辑应用技术研究组